Prévalence, profils de virulence et signification clinique des variants négatifs de la toxine shiga de l’infection à Escherichia coli O entérohémorragique chez les humains

Contexte Escherichia coli O, du clone H, existe chez l’homme et dans l’environnement en tant que Stox toxine Stx-positive et Stx-négative Stx production par des organismes infectants est considérée comme une condition critique pour le développement du syndrome hémolytique et urémique HUS, qui Chez les patients infectés par E coli O, on ne sait pas si la perte du gène stx au début d’une infection à E. coli entérohémorragique prévient le SHU ou si l’absence du gène stx de E. coli O réduit ou supprime la virulence. la fréquence des isolats E coli O stx-positifs et stx-négatifs dans les échantillons de selles provenant de patients ayant présenté des cas sporadiques de diarrhée ou de SHU, ainsi que la fréquence dans les échantillons obtenus pendant les éclosions, et l’évolution clinique de la maladie. coli O isolats obtenus à partir d’échantillons liés à des cas sporadiques de diarrhée, les souches stx-négatives représentaient% La proportion de souches stx-négatives était significativement salut % parmi les isolats d’E. coli O non fermants sorbitol-fermentants% que parmi les isolats E. coli O: H non isolants au sorbitol ou non-isolants%; P & lt; Des isolats d’E. coli O fermentant le stx-sorbitol négatif ont également été observés dans des échantillons liés à des éclosions de SHU et à des éclosions de diarrhée causées par la bactérie E coli O non ferro-fermante au sorbitol; En outre, ils étaient les seuls pathogènes qui ont été isolés dans d’autres foyers de diarrhée sans HUSConclusions. Des souches de E. coli O stx-négatives isolées à partir de selles de patients sont soit des souches intrinsèquement stx-négatives qui causent principalement des diarrhées non compliquées, soit des souches d’origine entérohémorragique. E coli O par la perte du gène stx au cours de l’infection; ces dernières souches peuvent encore causer une maladie grave

La bactérie E. coli O: H, E. coli entérohémorragique, est l’isolat EHEC le plus répandu associé à la diarrhée, la colite hémorragique et le syndrome hémolytique et urémique HUS dans le monde Les bactéries EHEC O produisent des toxines Shiga qui inactivent la biosynthèse des protéines. tuer les cellules sensibles La période d’incubation typique est – jours ; ceci est suivi d’une diarrhée aqueuse qui devient sanglante après plusieurs jours Parmi les patients & lt; l’infection à E. coli O: H se développe en ~%, et l’état de la définition du cas est atteint environ une semaine après le début de la diarrhée Pour identifier ce pathogène, des caractéristiques phénotypiques, comme l’absence de fermentation du sorbitol, sont utilisées. pour le différencier des autres souches de E coli EHEC O inhabituelles ont été découvertes en Allemagne en, lors d’une épidémie de SHU Ces souches EHEC O diffèrent de manière importante du sérotype O: H: elles fermentent le sorbitol après incubation pendant la nuit sur la gélose au sorbitol MacConkey, ils produisent de la β-glucuronidase GUD, et ils sont non NM NM La pathogénicité de SF EHEC O fermentant le sorbitol a été démontrée dans plusieurs études [,,]; de tels organismes représentent désormais>% des cas de SHU en Allemagne , et ils ont provoqué de grandes épidémies [, -] Au cours de la dernière décennie, des souches SF EHEC O: NM ont également été identifiées dans d’autres pays européens. , -], Australie , et Asie Bien que SF et EHEC O non SF appartiennent au même groupe phylogénétique et possèdent fliC codant pour l’antigène H, l’analyse des génomes de SF E coli O: NM et de E coli O: H démontre une diversité génétique substantielle Ces groupes de souches E coli O diffèrent par l’information génétique qui code pour les déterminants potentiels de la virulence et les voies métaboliques [,,, -], ainsi que dans la taille et dans le contenu de leurs grands plasmides [ Le plasmide de SF EHEC O: NM contient un groupe de gènes sfp codant pour les fimbriae et une hémagglutinine , qui ne se trouve pas dans E. coli d’autres pathogroupes E. coli O: H et SF E. coli O: NM souches possèdent stx- codant les bactériophages tempérés qui s’intègrent dans divers sites du chromosome bactérien [,,, -] Comme avec d’autres patho les bactéries géniques, telles que Corynebacterium diphtheriae, Vibrio cholerae et Clostridium botulinum, qui existent dans la nature en tant que souches toxigènes et non toxigènes selon qu’elles possèdent ou non des toxines spécifiques codées par le prophage, E coli O se présente comme stx-positif et stx-négatif variantes; ces variants ont été isolés chez des patients [,,, -] et des bovins Cependant, on sait peu de choses sur la fréquence de l’infection à E. coli O stx-négative chez les patients car les procédures sont couramment utilisées pour dépister l’infection EHEC. Dans les laboratoires cliniques, rechercher des gènes stx ou stx Dans cette étude, nous avons isolé des souches stx-positives et stx-négatives de E coli O en combinant des procédures de détection stx-dépendantes et stx-indépendantes Pour mieux comprendre les relations de ces isolats, nous avons comparé leurs gènes de virulence putatifs et étudié leur contexte phylogénétique Une autre question abordée dans cette étude est de savoir si la perte de gènes stx de E. coli O réduit la virulence de cet organisme chez les humains

Matériaux et méthodes

Souches bactériennes Au cours du travail de diagnostic de routine de janvier à juillet, nous avons testé des échantillons de selles prélevés sur des patients individuels en Allemagne présentant une diarrhée cliniquement bien définie, des patients ou des patients atteints de SHU; des échantillons de selles supplémentaires ont été obtenus pendant le suivi d’un sous-groupe de ces patients. Nous avons isolé des souches sto-positives / eae-positives et stx-négatives / eae-positives de E coli O: H / NM provenant des échantillons de selles de patients ayant eu des cas sporadiques de cas HUS ou de cas sanglants ou de cas non sanglants Tableau de diarrhée Des échantillons ont été prélevés – jours médians, jours après le début de la diarrhée. La procédure utilisée pour isoler les souches a été décrite précédemment [,,] h; ° C; rpm en mL de GN Broth Hajna Difco Laboratories E. coli O a été recherché en mL de la culture d’enrichissement en utilisant une séparation immunomagnétique avec des particules de Dynabead revêtues d’anticorps contre le lipopolysaccharide O Dynal Biotech ASA; Après incubation pendant une nuit, la croissance entière des plaques a été récoltée dans des mL de solution saline et des cellules ont été utilisées comme matrice dans la PCR ciblant stx, stx, et la culture des organismes magnétiquement séparés a été réalisée sur sorbitol MacConkey agar et céfixime tellurite-sorbitol agar MacConkey. et eae gènes [,,] Pour les tests effectués depuis, nous avons également utilisé des amorces ciblant rfbO et sfpA Des isolats d’échantillons de selles qui avaient des résultats PCR positifs ont été principalement récupérés en utilisant l’hybridation par transfert de colonies aux gènes stx et / ou eae. -positif-positif / eae-positif, non-SF et GUD négatif, et SF et GUD positifs. Parmi les souches stx-négatives / eae-positives, non-SF et GUD-négatives, et SF et GUD sont positives. Toutes les souches ont appartenu au cliché H. Cinq souches de E. coli O stx-négatives / eae-positives liées à des cas sporadiques ont été décrites ailleurs En outre, les souches SF E coli O: NM, y compris les souches stx-positives / eae-positives et Des souches stx-négatives / eae-positives toutes possédant des souches ont été isolées au cours de flambées survenues en Allemagne, du tableau 3 à ces flambées ont été décrites [, -]; d’autres ont eu lieu dans et dans une institution pour personnes aveugles et dans différentes familles, respectivement tableau

Tableau View largeTélécharger la lameAssociation des souches d’Escherichia coli O isolées à partir de cas sporadiques d’infectionTable View largeTélécharger la diapositive Associations de souches d’Escherichia coli O isolées de cas sporadiques d’infection

Tableau View largeTélécharger DiapositiveIsolement simultané des souches NM d’Escherichia coli O non fermentescibles stx-positives et stx-négatives pendant les épidémiesTable View largeTélécharger DiapositiveIsolement simultané des souches NM non-fermantes stéroïdiennes stx-positives et stx-négatives Escherichia coli O pendant la flambée Définition des patients Patients avec La diarrhée sanglante était définie comme une diarrhée où le sang visible était noté dans les selles. HUS était défini comme un cas d’anémie hémolytique microangiopathique hématocrite & lt;%, avec des signes périphériques d’hémolyse intravasculaire, thrombocytopénie plaquettaire, & lt ;, plaquettes / mm, et l’insuffisance rénale concentration de créatinine sérique supérieure à la limite supérieure de la plage normale pour l’âge PCR PCR a été réalisée en utilisant un iCycler Bio-Rad avec des paires d’amorces KS-KS, LP-LP et SK- SK pour détecter stx, stx et eae, respectivement Gènes codant pour d’autres toxines cdt-V et EHEC-hlyA et adhésines efa, b fpA, autres gènes codés par plasmide katP, espP, etpD, et sfpA, et terF et ureC utilisés comme marqueurs pour des groupes de gènes codant pour la résistance au tellurite et l’uréase, respectivement, ont été détectés comme décrit [,,, -,] Phénotypes Sorbitol fermentation a été détectée sur gélose MacConkey sorbitol après incubation pendant une nuit L’activité GUD a été déterminée sur Difco Nutrient Agar avec -méthylumbelliferyl ß-D-glucuronide Becton Dickinson Free Stx dans les filtrats de selles et Stx dans les surnageants des souches E coli O ont été détectés en utilisant le test des cellules Vero. typage Des fragments internes de gènes domestiques adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA et recA ont été analysés comme décrit , à l’exception d’une nouvelle amorce avant pour icd ‘- CGATTATCCCTT ACATTGAAG-‘, qui a donné des résultats plus fiables Alleles et les types de séquences ont été attribués conformément au site Web de typage de la séquence multilocus E coli http: // webmpiib-berlinmpgde / mlst / dbs / EcoliAnalyse statistique Les différences entre les groupes ont été évaluées en utilisant le test Yates corrigé and et le logiciel Statcalc Epi-Info, version Centres pour le contrôle et la prévention des maladies et les valeurs P de l’Organisation mondiale de la Santé & lt; ont été considérés comme significatifs

Résultats

Proportion de coliformes sto-positifs / eae-positifs et stéro-négatifs / eae-positifs chez les cas cliniques sporadiques L’analyse des échantillons de selles obtenus chez des patients ayant présenté une infection sporadique par E. coli O a démontré la présence de souches stx-positives / eae-positives chez les patients et stx. -negative / eae-positive souches dans le tableau des patients La proportion de souches stx-négatives dans SF E coli O: NM [%] de était plus élevé que dans les E non-SF E: H / NM [%] de Cette différence était statistiquement significatif χ,; P & lt; ; % IC, – Au cours de l’étude, l’E coli O stx-négatif représentait% des isolats d’E coli O chez les patients atteints de SHU et chez les patients présentant un tableau de diarrhée chez tous les patients chez lesquels E coli O stx-négatif / eae-positif était isolé , les filtrats fécaux étaient négatifs en utilisant le test de cellules VeroIdentification de coli SFE négatif-positif / eae-positif pendant les flambées stéro-négatives / eae-positives SF E coli O: NM isolats ont été identifiés, avec des fréquences différentes, dans le tableau épidémies , la plupart des patients ont perdu du SF EHEC O; Cependant, les échantillons de selles de quelques patients ont donné une EFS coli O stx-négative / eae-positive. En cas d’épidémie de diarrhée, SF E coli O stx-négatif / eae-positif était plus fréquemment isolé que SF EHEC O et dans d’autres foyers numéros et, stx-négatif / eae-positif SF E coli O: NM était le seul tableau pathogène identifié Présence de gènes marqueurs qui différencient les non-SF EHEC O: H / NM de SF EHEC O: NM Pour déterminer si stx-négatif / Les souches eae-positives de E coli O sont apparentées à EHEC O: H / NM non-SF ou SF EHEC O: NM, nous les avons testées pour la présence de plusieurs gènes marqueurs dont il a déjà été montré qu’ils différencient ces groupes [, ,, -,] Parmi les isolats d’infections sporadiques, les souches SF E coli O: NM stx-négatives / eae-positives partageaient le spectre des gènes marqueurs avec SF EHEC O: NM, tandis que les souches stx-négatives / eae-positives -SF E coli O: les souches H / NM ressemblaient à des souches non EHEC O: H / NM non SF. De même, les souches E coli O stx-négatives / eae-positives SF isolées m les foyers ne différaient des isolats d’épidémie stx-positifs / eae-positifs respectifs que par l’absence de données stx non représentées. Ainsi, les souches stéro négatives SF E coli O: NM et non SF E coli O: H / NM sont étroitement apparenté aux souches EHEC stx-positives de chaque groupe E coli O. Toutes les souches d’E coli O qui ont été étudiées manquent de bfpA codant pour la sous-unité structurale des pili formant des faisceaux

Tableau View largeDownload slideDistribution de gènes de virulence présumés et d’autres locus parmi les souches stx-positives et stx-négatives sorbitol-fermentant SF NM nonmotile Escherichia coli O et les souches non-SF E coli O: H / NMTable Voir grandDownload slideDistribution des gènes putatifs de virulence et autres loci Parmi les isolats d’E coli O sélectionnés au hasard, y compris EHEC O: H, SF EHEC O: NM parmi les isolats de E coli O sélectionnés au hasard parmi les isolats de E coli O sélectionnés au hasard parmi les isolats de E. coli O non stéroïdiens et stx-négatifs. et les souches stx-négatives SF O: NM et non-SF O: H ont été analysées en utilisant un typage de séquence multilocus Les allèles de tous les locus étaient identiques entre les souches, sauf dans les cas où un seul échange de paires de bases était détecté. complexe clonal

Discussion

Cette hypothèse expliquerait notre découverte d’E coli O stx-négatif comme seul agent pathogène dans les cas de tableau HUS sporadique et parmi les souches isolées lors des poussées de SHU qui ont été causées une étude récente impliquant des patients atteints de SHU, nous avons suivi la stabilité des gènes stx et identifié des patients chez lesquels des E coli stx-positifs étaient présents dans l’échantillon initial de selles et des souches E coli stx-négatives du même sérotype ont été identifiées dans des échantillons Comme les profils plasmidiques et les profils PFGE des isolats stx-positifs et stx-négatifs étaient identiques ou étroitement apparentés et que l’activité cytotoxique dans les échantillons de selles provenant de patients atteints de souches E coli stx-négatives / eae-positives était absente, nous concluons que la perte de gènes stx s’est produite pendant l’infection L’observation que les souches stx-positives peuvent être remplacées par des souches stx-négatives dans quelques jours indique qu’un délai Dans le cas d’un patient de quelques jours seulement, le diagnostic peut être posé lorsque le pathotype diffère de celui qui aurait été obtenu auparavant. Les souches qui sont intrinsèquement stx négatives ont probablement provoqué la plupart des cas de diarrhée non sanglante et des foyers de diarrhée. les souches décrites dans cette étude, nous avons isolé SF e coli O: NM stx-négatif lors d’une épidémie affectant une seule famille en Autriche , où les isolats étaient indistinguables sur la base des résultats de l’empreinte génétique. inclus les enfants qui ont souffert de diarrhée aqueuse sévère pendant et jours, respectivement; Les adultes étaient asymptomatiques Une autre question importante est de savoir si la perte de stx au début d’une infection par EHEC réduit le risque de développer un SHU. Cependant, cette étude a révélé que la perte de stx due à E coli O: H est extrêmement rare. répondu; de tels patients sont difficiles à identifier La perte de stx dans les infections à SF EHEC O: NM est cependant plus fréquente; en nombre de foyers, nous avons démontré la conversion d’une souche initialement stx-positive en une souche stx-négative et l’implication subséquente de cet organisme dans la propagation de la maladie. Aucun des patients infectés n’a développé de SHU. a une pertinence clinique, car il peut être associé à une maladie plus bénigne. Cependant, les cas de SHU dans lesquels E coli O stx-négatif a été isolé démontrent clairement qu’une infection avec un EHEC stx-positif, même quand elle dure seulement quelques jours, pourrait être suffisant pour induire le SHU; par conséquent, l’évolution dans le temps de la perte de stx lors d’une infection devrait faire l’objet d’études ultérieures. De plus, les conditions conduisant à la perte de stx chez un hôte infecté méritent également d’être étudiées plus avant. qui facilitent l’excision des bactériophages codant pour Stx peuvent être développésUne dernière question concerne la terminologie utilisée pour décrire les souches styx-négatives / eae-positives d’E coli O E coli entéropathogènes EPEC partagent le gène eae avec les variétés les plus courantes d’EHEC, mais elles manquent stx EPEC diffèrent également de EHEC en ce qu’ils portent typiquement le plasmide de facteur d’adhérence EPEC qui code pour les pili formant un faisceau Un sous-ensemble d’EPEC appelé “EPEC atypique” ne possède pas le facteur d’adhérence EPEC , mais ces souches Posséder eae En utilisant cette définition, les souches E coli O stx-négatives / eae-positives dépourvues du plasmide du facteur d’adhérence EPEC satisferaient aux critères de l’EPEC atypique. Cependant, SF E coli O: NM sta négatif Les souches stx-positives et stx-négatives sont génétiquement étroitement apparentées Par conséquent, nous proposons la classification de E coli O stx-négatif / eae-positive du clone H comme des variants stx-négatifs de l’EHEC , plutôt que comme EPEC atypique, parce que ces organismes trouvés dans les échantillons de selles de patients atteints de colite hémorragique et HUS proviennent de EHEC par la perte de stx. La désignation d’un «variant stx-négatif de EHEC» chez un patient souffrant de diarrhée sévère devrait Le médecin traitant considère que ce patient était initialement infecté par une souche d’EHEC et risque toujours de développer une insuffisance rénale. Les enfants atteints d’une telle infection doivent être hospitalisés et bénéficier de l’administration de fluides isotoniques intraveineux, comme cela a été démontré pour l’infection. avec EHEC O: H De plus, une telle désignation aiderait également un service de santé publique à cibler correctement une enquête épidémiologique et à mettre en œuvre des mesures de protection appropriées. e mesures contre la transmission Dans plusieurs tableaux épidémiologiques, le diagnostic initial d’une variante stx-négative de l’EHEC O a conduit à une détection rapide des foyers, permettant ainsi la mise en place sans délai de mesures de santé publique appropriées. ces pathogènes, qui est toujours le seul moyen de prévenir une maladie grave

Remerciements

Nous remercions Phillip I Tarr Université Washington School of Medicine, St Louis, MO pour des discussions fructueuses et Nadine Brandt pour l’assistance techniqueSupport financier Centre Interdisciplinaire de Recherche Clinique Projet IZKF Münster no Ka //; à AWF, WZ, MB, et HK, et le réseau d’excellence EuroPathoGenomicsPotential conflits d’intérêts Tous les auteurs: pas de conflits