Polymorphismes nucléotidiques simples dans TLR sont fortement associés à la susceptibilité à la méningite bactérienne chez les enfants

Contexte La méningite bactérienne BM est une infection sévère principalement causée par Streptococcus pneumoniae et Neisseria meningitidis NM Cependant, la susceptibilité génétiquement déterminée à développer des infections graves par ces microorganismes est variable entre les individus TLR reconnaît l’ADN bactérien conduisant à la signalisation inflammatoire intracellulaire SNP polymorphismes mononucléotidiques Méthodes Nous avons étudié le rôle des SNP TLR dans la défense de l’hôte contre BM Deux SNP TLR et des haplotypes TLR ont été déterminés chez des survivants de BM et comparés à des témoins sainsResults Carriage du mutant TLR-A était significativement diminué chez les patients atteints de méningite à méningocoque MM comparés aux témoins p:, odds ratio [OR]:,% intervalle de confiance [IC]: – TLR haplotype I était associé à une susceptibilité accrue à MM p:, OU ,% CI: – L’analyse in silico montre fort potentiel immuno-inhibiteur pour l’ADN de NM après reconnaissance par TLR CpG indice de -Conclusions Nous rapportons une association de SNP TLR avec la susceptibilité à BM, spécifiquement MM indiquant un effet protecteur de l’allèle TLR-A Nous émettons l’hypothèse que le mutant TLR-A dans une régulation à la hausse de la réponse immunitaire induite par TLR compensant le fort potentiel inhibiteur de l’ADN NM CpG

CONTEXTE

La méningite bactérienne BM est une maladie infectieuse grave et potentiellement mortelle du système nerveux central (SNC) qui survient souvent chez les jeunes enfants maladie de lyme. Malgré un traitement antibiotique adéquat et l’utilisation de traitements adjuvants tels que les corticostéroïdes, les taux de mortalité et de morbidité demeurent élevés. Les pathogènes communs responsables de BM chez les enfants du monde occidental sont Streptococcus pneumoniae SP et Neisseria meningitidis NM L’incidence de BM, définie comme une bactérie isolée du LCR du liquide céphalorachidien, était par habitant pour la méningite à pneumocoques et aux Etats-Unis pour la méningite à méningocoques. est beaucoup plus élevé dans les pays en développement où les taux de vaccination sont bas. Une étape cruciale dans la défense de première ligne contre la BM est la reconnaissance des bactéries par les mécanismes immunitaires innogènes, en utilisant des récepteurs PRR exprimés sur les cellules présentatrices et phagocytaires. structures neurales et structures non neurales incluant les macrophages et la tanière Dans le SNC, les TLR sont exprimés sur les astrocytes présentant l’antigène et les microglies monocytaires TLR est un PRR intracellulaire qui reconnaît le cytosine-fosfate non méthylé. motifs de la guanine CpG dans l’ADN bactérien et viral La liaison de TLR à l’ADN non-self déclenche une cascade de signalisation intracellulaire, aboutissant finalement à la transcription de facteurs nucléaires et à la production de cytokines pro- et anti-inflammatoires SNP polymorphismes nucléotidiques simples identifiés dans différents gènes TLR, et ils affectent la susceptibilité et la gravité de plusieurs maladies inflammatoires Par exemple, le TLR A & gt; G AspGly SNP provoque une hyporéactivité au lipopolysaccharide LPS, un contenu important dans la membrane de NM et a été montré pour augmenter la sensibilité aux infections NM [Smirnova et al ont examiné un grand groupe n = de patients atteints de septicémie méningococcique et ont comparé la fréquence de TLR changements de codification de ceux dans un groupe témoin ethniquement apparié n = Ils ont observé que rares mutations hétérozygotes faux-sens de TLR contribuent de manière significative au risque de développer une septicémie méningococcique dans une population blanche p: × -; odds ratio [OR]: Yuan et al ont comparé les SNP dans TLR et TLR entre les enfants atteints de pneumococcie invasive et les donneurs de sang en bonne santé et a conclu que la prévalence de la TLR A & gt; G / TLR C & gt; T SNP était significativement plus faible chez les patients que chez les témoins p & lt; , OU: ; % IC: – Activation médiée par TLR par kinase associée à un récepteur d’interleukine IRAK est une enzyme importante dans le fonctionnement des TLR Huit différents SNP IRAK sont associés à des infections récurrentes à pneumocoques et à méningocoques, caractérisés par l’absence de fièvre et l’absence de réponse au LPS dans les tests de sang total in vitro Une étude gambienne sur la méningite n’a pas montré d’association exclusive entre TLR A & gt; G Les SNP et la susceptibilité au MM pendant les épidémies chez les enfants n = Des défauts génétiques de l’immunité innée ont été décrits dans les infections méningococciques et pneumococciques au sein des familles. Une grande étude chez des Blancs britanniques a montré que les facteurs génétiques de l’hôte contribuaient jusqu’à un tiers la susceptibilité à la méningococcie Bien que de nombreuses études sur la variation génétique des TLR et des infections à SP et NM aient été décrites, les études portant exclusivement sur la méningite sont rares.Le but de cette étude est d’étudier le rôle des SNP TLR dans la susceptibilité aux PM. Les SNP MM TLR ont été associés à la susceptibilité à la pouchite, au lupus érythémateux disséminé, à l’athérosclérose et à l’asthme , mais aucune association de SNP SNR avec BM ou infections à méningocoque et pneumocoque n’a été décrite. la reconnaissance des motifs CpG dans les bactéries causant la BM, entraînant une diminution ou une augmentation de la sensibilité aux particules et MM Pour étudier le rôle des SNP TLR dans la susceptibilité à BM, nous avons comparé les fréquences des SNP TLR, représentant TLR et TLR- et leurs haplotypes, chez les survivants de BM n = avec ceux des témoins sains n = sans un historique connu de BM To déterminer l’importance de la CpG dans SP et NM et de sa capacité immunostimulante, nous avons également effectué une analyse in silico, un balayage informatique des génomes bactériens pour des motifs stimulants et inhibiteurs CpG

Méthodes

Les patients

Ces patients ont été sélectionnés à partir de données sur des isolats bactériens du LCR du Laboratoire de référence néerlandais pour la méningite bactérienne. L’âge moyen d’infection était de plusieurs années parmi les enfants participants,% Au total, les enfants ont eu une méningite entre janvier et décembre, et cette cohorte a été décrite en détail par Koomen et al Une cohorte similaire d’enfants avait BM entre et les enfants avec “apparition complexe” de la méningite définie comme : la méningite secondaire à un état d’immunodéficience, une chirurgie du SNC, un traumatisme crânien ou une infection par shunt du LCR ou une méningite récurrente ont été exclues [%]

Contrôles

Le groupe de contrôle se compose de blancs hollandais sains adultes sans antécédents connus de BM Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des employés en bonne santé du VU University Medical Center à Amsterdam et de l’Erasmus University à Rotterdam, aux Pays-Bas. Parmi ces patients,% de tous les patients à qui l’on a demandé de participer ont retourné le tampon et un formulaire de consentement éclairé. Le comité d’éthique médicale du VU University Medical Centre a approuvé cette étude

Isolement d’ADN

L’ADN a été isolé à partir des écouvillons buccaux en utilisant la procédure suivante: après addition de μL mmol / L de Tris-HCl pH, l’échantillon a été chauffé à des degrés Celsius pendant quelques minutes Après mélange pendant quelques secondes, les écouvillons ont été prélevés et l’échantillon a été centrifugé. le sang – mL a été prélevé et l ‘ADN génomique a été isolé en utilisant des protocoles standards; – ng d’ADN génomique a été utilisé pour chaque cycle de génotypage

Génotypage

Les polymorphismes ont été analysés par analyse TaqMan en utilisant le protocole standard TaqMan. Le système de détection de séquence AbiPrism Applied Biosystems a été utilisé pour obtenir des données. Les amorces et sondes utilisées pour TLR- étaient: amorce directe ‘-GGCCTTGGGATGTGCTGTT-‘ et amorce inverse ‘-GGTGACATGGGAGCAGAGACA-‘ et double Les marqueurs et les sondes utilisés pour le TLR étaient: amorce directe ‘-CCGCTGTGCAGGTGCTAGAC-‘ et l’amorce inverse ‘-CCAAAGGGCTGGCTGTTGTA-‘ et double marqueur étiquetés fluorocarbone marqués CTGCCTGAAAACT- ‘Fluor Label FAM, -carboxyfuorescéine et CTGGAAACTCCCC-‘ Fluor Label VIC hybridation fluorgénique des sondes MGB AGCTACCGCGACTGG- ‘Fluor Label FAM et AGCTACCACGACTGG A-‘ Fluor Label VIC

Haplotypes

Les SNP TLR que nous avons analysés ont été choisis sur la base d’une étude de Lazarus et al dans laquelle un ensemble de SNP TLR, TLR, TLR et TLR de TLR a été décrit. Génotypage de TLR-T & gt; C NCBI SNP GROUPE ID: rs et TLR G & gt; Un ID de groupe SNP NCBI: rs permet de distinguer tous les haplotypes de locus Haplotype I: -T / -T / A / G, Haplotype II: -C / -T / G / A, Haplotype III: -T / -C / G / A, Haplotype IV: les haplotypes de TLR -T / -C / G / G ou -C / -T / G / G ou C / -C / G / G ou -T / -T / G / A ont été déduits en utilisant PHASE v et SNPHAP

Statistiques

Les génotypes ont été comparés entre les cas et les témoins pour le groupe PM et MM séparément et pour tous les cas de BM Hardy. Les tests Weinberg ont été utilisés pour tester l’héritage mendélien. Le test exact de Fisher et le test were ont été utilisés le cas échéant. ont été considérés comme statistiquement significatifs

Dans l’analyse Silico

Pour déterminer la capacité immunostimulante de l’ADN CpG dans SP et NM, nous avons effectué une analyse in silico comme décrit par Lundberg et al Pour déterminer la prévalence relative des motifs CpG canoniques stimulantes et inhibitrices dans les séquences génomiques des différentes bactéries, nous employé une approche en deux étapes Les fichiers texte au format FASTA récupérés par Genbank ont ​​été téléchargés sur ‘http: // insilicoehues /; et la fréquence de tous les hexamères possibles a été déterminée comme décrit par Bikandi et al Cette information et la composition générale de chaque génome a ensuite été saisie dans Microsoft Excel, et des formules communes ont été utilisées pour compter l’occurrence de motifs CpG spécifiques. L’indice CpG est utilisé pour faciliter la comparaison des potentiels immunostimulants indépendamment de la taille du génome, de la teneur en GC et de la suppression globale des CpG et a été calculé en comparant la fréquence des motifs CpG stimulants et inhibiteurs

RÉSULTATS

Analyse de susceptibilité

Analyse SNP unique

Pour l’analyse de susceptibilité, les patients BM ont été comparés au groupe témoin. Les groupes PM et MM ont également été comparés séparément aux témoins. Les patients PM et MM ont également été comparés afin de découvrir les associations entre les SNP et la sensibilité à un pathogène spécifique. Tableau A et B Parce que les concentrations et la qualité de l’ADN varient d’un échantillon à l’autre, certains échantillons qui n’ont pas pu être génotypés après une ou plusieurs analyses TaqMan ont été exclus Ceci explique la différence entre le nombre de patients inclus et le nombre de patients génotypés dans les tableaux

Tableau ATLR Distribution du génotype dans les cas et les contrôles TLR N GG Type sauvage% GA Hétérozygote% AA Mutant% Total BMa S pneumoniae N meningitidisb Témoins * TLR N GG Type sauvage% GA Hétérozygote% AA Mutant% Total BMa S pneumoniae N meningitidisb Témoins * aTLR mutant allèle génique allèle GA ou AA a été significativement diminué chez les patients BM par rapport aux témoins p:, OR, allèle mutant% CI – bTLR a été le plus significativement diminué chez les patients MM par rapport aux témoins en bonne santé p:, OR:, CI: View LargeCarriage of the Les génotypes de l’allèle mutant TLR GA ou AA étaient significativement diminués chez les patients BM par rapport aux témoins p:, OR,% CI – Le transport de l’allèle mutant TLR était également significativement diminué chez les patients MM par rapport aux témoins sains. -, mais la distribution du génotype chez les patients atteints de MP ne différait pas significativement des témoins sains. différences significatives entre les patients PM et MM Le TLR-SNP n’était pas significativement associé à la susceptibilité à BM

Analyse d’haplotype

Le génotypage à la fois des TLR et des TLR permet de distinguer tous les haplotypes de locus. Les résultats sont résumés dans le tableau. L’haplotype TLR I était significativement augmenté chez les patients BM par rapport au groupe témoin; p:, OR,% CI – L’haplotype TLR I était significativement augmenté chez les patients MM par rapport aux témoins sains; p:, OR,% CI: – Il n’y avait pas de différences significatives dans la distribution de l’haplotype I entre le groupe PM et les témoins, ni entre le groupe PM et MM Pour la distribution des autres haplotypes, aucune différence significative n’a été trouvée entre le groupe témoin et le groupe témoin. groupe total de patients BM, ni entre les patients PM et MM séparément

Tableau Fréquences des TLR Haplotypes dans les cas et les contrôles haplotypes TLR n Ia% IIb% IIIc% IVd% Total BM * S pneumoniae N meningitidis * Contrôles * TLR haplotypes n Ia% IIb% IIIc% IVd% Total BM * S pneumoniae N meningitidis * Contrôles * Ad: Haplotypes tels que définis par Lazarus et al * L’haplotype TLR I était significativement augmenté chez les patients BM par rapport au groupe témoin; p:, OR,% CI – L’haplotype TLR I était significativement augmenté chez les patients MM par rapport aux témoins sains; p:, OR,% CI: – Voir grand

Dans l’analyse Silico

Dans le tableau, nous avons résumé les indices CpG pour les agents causals de BM. Les indices CpG indiquent des propriétés immunostimulatrices, tandis que les valeurs négatives indiquent des propriétés immuno-inhibitrices. agent de la méningite, H influenzae Fait intéressant, pour NM, nous avons trouvé un index CpG immunoinhibitory très forte de –

Tableau Résultats de l’analyse In Silico CpG motif déviationa Bactérie Génome Total CpGd Motifs de consensusb CpG indexg Taille Mb GC% CPG / kbc Stimulatoire Inhibitoryf Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis – Haemophillus influenzae CpG motif déviationa Bactérie Génome Total CpGd Motifs de consensusb CpG indexg Taille Mb GC% CPG / Interdiction de Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis – Haemophillus influenzae aDéviations des occurrences de motifs spécifiées par rapport à celles attendues sur la base de la GC génomiquebLes motifs hexamères CpG stimulants et inhibiteurs du consensus sont basés sur une analyse publiée. Ils sont utilisés dans ce tableau comme indicateurs des fréquences générales de stimulation. et des motifs hexamères CpG inhibiteurs dans chaque génome. Nombre de motifs hexamères CpG NNCGNN apparaissant dans chaque génome normalisé à la fréquence kbdTotale des motifs hexamères CpG NNCGNN; NRCGNN et NNCGRNgCalculés à partir de fréquences de motifs hexamères consensus moins stimulants et stimulants en tant qu’indicateur de stimulation contre inhibition multiplié par le nombre total de CpG normalisé par rapport à kb et à l’ensemble de l’hexagone. fréquence de CpG NNCGNNView Large

DISCUSSION

dans les PM, alors que la déficience TLR supplémentaire n’a pas entraîné une atténuation supplémentaire de la réaction inflammatoire observée TLR-TLR-double souris déficientes Nous n’avons pas trouvé cet effet protecteur TLR dans notre cohorte SP La force de cette étude est que nous nous concentrons exclusivement sur Nous avons recruté un groupe important de survivants de MM et avons trouvé des résultats très significatifs Notre cohorte de survivants de PM était relativement petite, et nous n’avons pas pu trouver de résultats significatifs pour ce groupe. Dans notre étude, nous avons utilisé Cependant, comme l’incidence maximale de BM aux Pays-Bas était faible, l’incidence par habitant a varié entre et pendant la période – aux Pays-Bas , nous l’avons considéré comme un groupe de contrôle représentatif pour la recherche immunogénétique sur l’ADN BM des enfants atteints de BM mortelle qui a subi les infections les plus graves n’était pas disponible Cependant, l’inclusion de l’ADN des cas fulminants ne fera que renforcer l’association que nous avons trouvée pour la susceptibilité au BM, bien que de futures études portant spécifiquement sur la sévérité du BM seraient intéressantes à cet égard, mais ces cas sont rares et les cas de Les études génétiques peuvent révéler des SNP pertinents dans les gènes de réponse immunitaire influençant la pathogenèse des BM. Cela pourrait également identifier des cibles potentielles de médicaments. Par exemple, les résultats de cette étude guideront les futures études génétiques sur la sensibilité et la sévérité des BM. L’activation du TLR conduit à la production de cytokines principalement par le facteur nucléaire kappa B NFκB et la famille MAPK des protéines kinases activées par mitogène Les essais cliniques sont préparés pour bloquer la transcription NFκB et MAPK Cependant, aucun de ces médicaments potentiels n’est encore utilisé. de SNPs spécifiques pourraient être utilisés pour développer un traitement personnalisé adapté au profil génétique du patient e et diminution des effets secondaires Les patients porteurs de SNP connus pour influencer la réponse immunitaire pourraient recevoir des médicaments pour stimuler ou inhiber cette réponse. Une meilleure compréhension du rôle de l’immunogénétique dans la pathogenèse de la BM peut permettre de prédire le risque individuel de développer BM. approche du suivi Outre les facteurs cliniques, les SNP peuvent être des marqueurs précieux pour prédire les conséquences à long terme de la MB, y compris la perte auditive, et les complications neuropsychologiques [,,] à un stade précoce de la maladie. Les SNP dans les gènes de l’immunité innée et les résultats des infections SP et NM Trois étapes importantes doivent être franchies pour traduire ces résultats dans la prise en charge du patient: l’étude doit être confirmée et l’ajout de SNP dans d’autres gènes doit être ajouté pour obtenir une synergie dans la prédiction de la susceptibilité ou de la protection de BM, ce trait génétique doit être ajouté aux poten renforcer les règles actuelles de prédiction clinique sur les taux de complication après BM qui incluent la perte auditive et les limitations académiques et comportementales , et mettre en œuvre des stratégies pour accélérer la transmission des connaissances génétiques du laboratoire au chevet du patient. Cette connaissance permettra non seulement aux interventions cliniques mais aussi aux messages de promotion de la santé et aux programmes de prévention des maladies d’être ciblés sur les individus sensibles ainsi que sur les sous-groupes de la population en fonction de leur génomique et de leur génomique. profil santé personnalisée Le domaine impliqué dans cette traduction est appelé Génétique Santé Publique qui a comme tâche principale “la traduction responsable et efficace des connaissances génomiques et des technologies dans la politique publique et les services de santé au profit de la santé de la population” Bellagio ,: voir wwwgraphintorg pour En résumé, nos résultats fournissent une autre étape vers l’utilisation des SNP dans les gènes de réponse immunitaire comme des marqueurs précieux pour évaluer le risque de développer des études immunogénétiques supplémentaires avec des échantillons de plus grande taille, des cohortes de validation et le génotypage incluant plusieurs gènes synergiques. aider à élucider la physiopathologie de la méningite et expliquer la variabilité inter-patiente de BM, en grande partie en fonction de la capacité du système immunitaire inné à éliminer l’infection, avec pour but ultime de prédire l’évolution et l’issue de l’infection. Les auteurs reconnaissent Jolein Pleijster au Laboratoire d’Immunogénétique du Centre Médical de l’Université VU pour une assistance technique experte et à Rogier de Jonge, néonatologiste au département de pédiatrie du Centre Médical de l’Université VU, avec Arisja Mauritz, étudiant en médecine de l’Université VU pour son excellent support en données. inclusionPerspectives d’intérêts potentielles: Tous les auteurs: non conflits