Évolution limitée du type de virus de l’immunodéficience humaine dans le thymus d’un enfant infecté de façon périnatale

Contexte Implication du thymus pendant le virus de l’immunodéficience humaine L’infection par le VIH peut altérer la production de lymphocytes naïfs entraînant une déplétion plus rapide, mais les caractéristiques des souches primaires du thymus ne sont pas bien étudiées en raison de l’indisponibilité des tissus chez les individus vivants. VIH de type VIH- chez un enfant infecté périnatalement avec thymite et comparant les séquences génomiques de la région VIH-C-V du gène env dans le tissu thymique et le sang périphérique. Le thymus abritait principalement des séquences virales proches du VIH-fondateur. variante virale qui circulait dans le sang à l’âge de plusieurs mois, alors que le virus sanguin périphérique à des années d’âge avait évolué de manière importante. Les séquences virales des cellules T CD circulantes aux années d’âge étaient groupées phylogénétiquement avec celles du tissu thymique. réservoir viral thymique distinct et suggèrent que les cellules T CD circulantes ont été infectés dans le thymus, vraisemblablement au stade thymocyte CDCD Ils démontrent également que toutes les infections thymiques du VIH ne conduiront pas nécessairement à un dysfonctionnement thymique sévère Les caractéristiques de la souche virale qui ensemence le thymus peuvent dicter le taux de progression de la maladie

Le thymus est où les cellules souches hématopoïétiques se différencient en cellules T CD ou CD “naïves”, qui circulent ensuite dans le sang et peuplent les organes lymphoïdes L’infection du thymus par le virus de l’immunodéficience humaine VIH- peut perturber le processus de maturation des thymocytes. L’examen histologique du tissu thymique post-mortem des patients atteints du SIDA, y compris les fœtus et les nouveau-nés, a indiqué un certain nombre de changements pathologiques Expériences d’infection des explants thymiques humains dans le SCID-hu modèle de souris ou de cultures thymiques in vitro ont démontré que certaines souches de VIH du laboratoire, mais pas toutes, peuvent infecter les thymocytes ou les cellules épithéliales thymiques et provoquer une variété d’effets histopathologiques Plusieurs études in vitro ont montré que différentes souches de VIH ont des effets dissemblables sur le thymus, certaines souches virales liant le CXCR induisant le syncytium sont plus susceptibles disruption thymique Nous avons déjà signalé que ~% des nourrissons infectés par le VIH présentaient des profils de cytométrie en flux indiquant un dysfonctionnement thymique, avec une déplétion des lymphocytes T CD et CD, ainsi que des lymphocytes B CD Il reste à savoir si Malgré l’impact potentiel sur la progression de la maladie chez les enfants, la plupart des données disponibles sur l’infection par le VIH thymique ont été limitées à des modèles de laboratoire avec des souches de VIH isolées à partir de souches infectées par le thymus. sang périphérique Il existe des données très limitées sur les souches primaires de VIH récupérées directement du tissu thymique, en raison de la rareté des spécimens cliniques frais Dans une analyse des spécimens d’autopsie d’adultes atteints du SIDA par séquençage direct de la réaction en chaîne de la polymérase amplicons PCR , il a été trouvé que le thymus et les ganglions lymphatiques abritaient des quasi-espèces d’enveloppe étroitement apparentées; Dans une autre étude sur les autopsies d’enfants, des différences significatives ont été trouvées entre le sang et les variantes thymiques . Dans cette étude, nous décrivons les caractéristiques génotypiques de la quasispécie du VIH chez un enfant atteint d’une infection acquise périnatale. Les gènes HIV-env clonés directement à partir du tissu de biopsie thymique ont été analysés par rapport à ceux retrouvés dans les cellules mononucléaires du sang périphérique PBMC obtenues au moment de la biopsie ainsi que dans les échantillons de PBMC recueillis peu de temps après la naissance du même individu. Ils ont également suggéré un réservoir viral compartimenté dans le thymus qui a subi une diversification relativement limitée de la souche VIH fondatrice. L’exportation du virus du réservoir thymique vers le sang périphérique a probablement eu lieu, mais le flux inverse n’a pas été observé. apparent

Méthodes

Sujet de l’étude La patiente était une Afro-Américaine âgée d’un an avec une infection VIH acquise périnatale. A l’âge de quelques années, une masse médiastinale était observée sur une radiographie thoracique de routine Une tomographie thoracique informatisée du thorax démontrait une masse médiastinale thymique multicystale antérieure. symptômes attribués à cette découverte Son évolution clinique a été caractérisée par l’absence d’infections opportunistes, un léger retard de développement, un retard staturo-pondéral, et plusieurs infections bactériennes telles que la pneumonie pneumococcique, la shigellose et les infections récidivantes de l’oreille. sur la zidovudine depuis l’enfance, et la lamivudine a été ajouté à son régime à des années avant la disponibilité des combinaisons antirétrovirales hautement actives Au moment de la radiographie thoracique, elle avait un nombre de cellules CD / mm, un nombre de cellules CD / mm, et une charge de virus de copies / mL Le patient a subi une biopsie diagnostique à coin ouvert des médias masse stinale en février Le tissu thymique qui a été excisé consistait en un kyste multiloculé lymphoépithélial bordé d’un épithélium plat et d’un bord de tissu lymphoïde avec des follicules germinaux. On a observé un tissu thymique reconnaissable dans les couches externes. Préparation des thymocytes Après la capsule thymique, les vaisseaux sanguins et conjonctifs Les thymocytes, ainsi que des cellules épithéliales thymiques intercalées, ont été libérés dans une suspension monocellulaire à travers un tamis cellulaire; Faucon; Le sang hépariné a été dilué: volume dans la solution de sel tamponnée de Hanks additionnée de% de sérum de veau fœtal Les PBMC ont été isolées par centrifugation en gradient dans Histopaque Sigma Chemicals à g pendant min. Les cellules à l’interface ont été collectées, lavées et granulées. La séparation des cellules CDT Les PBMC ont d’abord été appauvries en cellules CD par des cycles de traitement d’adsorption avec des billes macromagnétiques revêtues d’anticorps monoclonaux spécifiques à CD Dynal AS, selon les instructions du fabricant. Miltenyi Biotec L’analyse de cytométrie de flux du sous-ensemble isolé a montré que l’ADN d’extraction d’ADN purifié à partir de PBMC ainsi que de cellules thymiques a été extrait à l’aide du QIAamp Blood Kit Qiagen, selon la instructions du fabricantPrimers pour l’amplification PCR HIV-env L’amplification génique a été réalisée par analyse PCR nichée, comme décrit dans Delwart et al. Une aliquote de l’ADN extrait a été utilisée pour le premier cycle d’amplification en utilisant les amorces ED et ED et les conditions décrites dans Delwart et al. Les ES ont ensuite été utilisés pour le second tour d’amplification sur une aliquote de la première réaction. Les réactions d’amplification ont été réalisées dans un thermocycleur pour les cycles ° C pour min, ° C pour min et ° C pour min et une extension finale à ° C Pour le clonage, un μL de chaque produit de la réaction de PCR a été séparé par électrophorèse sur un gel d’agarose. La bande d’intérêt spécifique ~bp a été excisée du gel, purifiée et ligaturée dans le plasmide pCRII Invitrogen Après transformation dans Escherichia coli, à L ‘ADN plasmidique a été criblé sur un gel d’ agarose en% après digestion par Eco RI pour confirmer le séquençage correct de l ‘ADN et l’ analyse phylogénétique Toutes les séquences d ‘ADN du les clones ont été déterminés en utilisant le kit de séquençage d’ADN ABI Prism séquençage du cycle de terminaison de colorant prêt à réagir sur un séquenceur automatique modèle ABI M Les amorces sens et antisens ainsi que les amorces ES et ES ont été utilisées pour le séquençage Les régions chevauchantes ont été identifiées en utilisant le logiciel MacVector Oxford Molecular Sequences ont été alignés en utilisant la fonction CLUSTAL de la partie Megalign du progiciel Lasergene DNASTAR Les relations phylogénétiques ont été construites en utilisant des algorithmes de jointure voisins Des relations phylogénétiques similaires ont été trouvées dans les répliques bootstrap des arbres voisins.

Résultats

Variabilité du VIH-envgène dans le sang périphérique et le tissu thymique à des années Dix-huit clones env de VIH couvrant la région C-V, générés à partir de l’ADN des PBMC clones P-P ou clones de tissus thymiques T-T, ont été séquencés. une homologie de séquence a été trouvée dans la région V de tous les clones, quelle que soit l’origine tissulaire. Une transversion A-to-T dans les clones P, P et P dérivés des PBMC a produit un changement d’acide aminé tyr à phe à la base du Boucle V Au niveau de l’acide aminé déduit, seuls les variants V ont été identifiés dans les PBMC, l’un avec les clones du phénotype tyrosine et l’autre avec les clones phénotype phénylalanine. Parmi les clones dérivés du thymus, T, T et T avaient un T-to-. G mutation transversion à la même position Cette mutation était muette Par conséquent, tous les clones du thymus présentaient une séquence d’acides aminés V déduite avec le phénotype tyrosine. Le tropisme et le phénotype prédits des clones ont été déterminés à partir des séquences nucléotidiques. es isolées de notre patient présentaient des séquences V suggérant l’utilisation du CCR , et un phénotype induisant un non-syncytium, basé sur la faible charge nette à pH, due à des substitutions d’acides aminés acides ou neutres aux positions et de la région V [ ]

sont des clones de produits amplifiés de PBMC échantillonnés à l’âge CD et CD sont des clones de CD T purifiés à partir de la même aliquote de PBMC utilisées pour P-PT-T proviennent de tissus de biopsie de thymus recueillis en même temps que les PBMC à Alignement de la région VIH-C-V des séquences d’acides aminés dérivées d’env Les clones m et m proviennent de cellules mononucléaires du sang périphérique Les cellules mononucléaires recueillies à l’âge et au mois, respectivement P-P sont des clones provenant de produits amplifiés des PBMC Les CD et CD sont des clones de cellules CD purifiées à partir de la même aliquote de PBMC utilisées pour P-PT-T provenant de tissus de biopsie de thymus recueillis en même temps que les PBMC à des années d’âge. une variabilité plus marquée de la composition et de la longueur de la séquence d’acides aminés entre les régions flanquantes conservées Une variation plus importante a été observée chez les clones dérivés du thymus, alors que les clones dérivés de PBMC étaient généralement plus homogènes De plus, des variants V uniques ont été observés chez les souches de thymus Un schéma d’insertion de nucléotide variable dans le cadre était caractéristique des clones dérivés du thymus Trois clones, T, T et T qui avaient des séquences nucléotidiques identiques, présentaient la région V la plus longue avec la longueur de région V commune des clones dérivés de PBMC L’insertion de nucléotides dans le cadre a été associée à la formation d’un nouveau site de N-glycosylation potentiel Six sites potentiels consensus pour la glycosylation N-linked ont été identifiés dans la plupart des clones des deux PBMC et le thymus Un site supplémentaire était présent pour les clones T, T et T Les clones P, T, T et T présentaient la perte du site potentiel de glycosylation N-lié. Ces nombres élevés de sites potentiels de glycosylation N-liés ont été reconnus comme caractéristique plus fréquente chez les individus chroniquement infectés Le clone PBMC P a montré% identité de séquence avec le clone thymique T et était juste – nucléotides divergents dans les mutations silencieuses des clones T et T Ceci peut suggérer le trafic des cellules infectées du compartiment du thymus vers le sang périphérique. Séquence du VIHenvgène dans les PBMC obtenues peu après la naissance Les PBMC cryoconservées qui ont été obtenues du même patient à des mois et des mois d’âge, respectivement, étaient disponibles pour analyse. Les séquences C-V étaient complètement identiques entre les espèces m et m, comme on aurait pu s’y attendre. Leur région V présentait également% d’homologie à toutes les espèces m et m. des clones dérivés du thymus T-T aux années d’âge et différaient des clones dérivés de PBMC par des substitutions d’acides aminés Lorsque la région V était comparée à celle des espèces fondatrices, les clones thymiques et PBMC par âge avaient généralement accumulé plus de mutations Néanmoins, le clone PBMC P et les clones thymiques T et T étaient identiques à la séquence fondatrice de m et m, alors que T divergé par les seuls acides aminés L’insertion dans le cadre trouvée dans certains clones thymiques était absente chez les espèces fondatrices La similitude entre les différents clones a été analysée plus loin phylogénétiquement comme décrit ci-dessousHIVenvgène dans les cellules CDT infection par le VIH des cellules T CD reste controversée [ Nous avons examiné l’explication possible que la présence occasionnelle du génome du VIH dans les cellules CD du sang périphérique est le résultat de la maturation des thymocytes CDCD infectés en cellules T positives simples. Des cellules CD du sang périphérique hautement purifiées ont été analysées. quantité d’ADN génomique CD T isolée, et parce que nous attendrions un petit pourcentage de cellules CD infectées, le cas échéant, le nombre de cycles de PCR a été augmenté à des cycles à la fois dans la première et la deuxième PCR Un produit amplifié a été détecté et cloné dans un plasmide vecteur PCR Deux clones CD et CD ont été séquencés Figure Sur la base des séquences C-V, un variant VIH- distinct a été trouvé dans Les cellules CD comparées à la population trouvée dans les PBMC non séparées. Fait intéressant, leur région V portait l’insertion dans le cadre qui a également été trouvée dans les clones thymiques.Analysephylogénétique des variants du VIH dans les différents compartimentsFigure montre les séquences d’acides aminés prédites alignées de tous les clones analysés Phylogénétique Les relations phylogénétiques ont été trouvées dans les répliques bootstrap des arbres voisins. L’arbre phylogénétique a indiqué que les espèces fondatrices m, m étaient plus proches des espèces thymiques, alors que Les clones PBMC forment une grappe séparée et distincte La seule exception est le clone P des PBMC, qui a été placé parmi les clones thymiques et proche des espèces fondatrices. Les séquences des clones des cellules CD du sang périphérique ont révélé une relation étroite avec plusieurs des clones thymiques et étaient à une plus grande distance de tous les clones PBMC

Figure Vue largeDownload slideArborescence hydrogénoïde de la région env C-V des acides aminés rééchantillonnage bootstrap des ensembles de données Les clones m et m proviennent de cellules mononucléaires du sang périphérique PBMC collectées à l’âge et au mois, respectivement P-P sont des clones du produit amplifié des PBMC échantillonnés à l’âge des années CD et CD sont des clones de CD Les lymphocytes T purifiés à partir de la même aliquote de PBMC utilisés pour P-PT-T sont issus de tissus de biopsie de thymus recueillis en même temps que les PBMC aux années d’âgeFigure View largeTélécharger diapositivePhylogénétique de la région env C-V des acides aminés rééchantillonnage bootstrap des ensembles de données Les clones m et m proviennent des cellules mononucléaires du sang périphérique Les cellules mononucléaires recueillies à l’âge et au mois, respectivement P-P sont des clones du produit amplifié des PBMC échantillonnés à l’âge de années CD et CD sont des clones de cellules T CD purifiées à partir de la même aliquote de PBMC utilisées pour P-PT-T proviennent de tissus de biopsie de thymus recueillis en même temps que les PBMC à des années de l’âge

Discussion

ce , qui peut affecter la pression immunologique locale ou systémique qui est considérée comme le principal moteur de la diversification du gène de l’enveloppe virale. En outre, il existe une restriction sélective des cellules T matures pour entrer à nouveau dans le thymus. l’effet sur la redistribution possible des quasi-espèces virales par les cellules infectées entre le sang périphérique et les compartiments thymiques est inconnu; L’analyse phylogénétique des séquences de PBMC dérivées du thymus chez des patients infectés de façon périnatale a montré des signes d’évolution virale spécifique au tissu. Cinq ans après l’événement de transmission, une importante évolution virale avait eu lieu à la périphérie, et l’espèce VIH «fondatrice» était la principale variante trouvée dans les PBMC à des mois et après l’infection est devenue une variante mineure En revanche, la population virale obtenue à partir du tissu thymique était plus proche de la souche fondatrice que les clones dérivés des PBMC actuelles. Ceci peut indiquer une pression immunologique moindre dans cet organe. La présence du clone variant du VIH fondateur P, qui est identique aux clones thymiques T et T dans le sang périphérique années après la transmission suggère que le thymus peut agir comme un réservoir qui a continué à e virus xport à la périphérie Le clone P peut représenter un virus dans les lymphocytes périphériques à longue durée d’infection latente. La présence de clusters phylogénétiquement distincts entre les clones thymiques et PBMC suggère que les lymphocytes infectés ne se déplacent pas librement entre le sang et le thymus. Les cellules T sont considérées comme la principale cible du VIH-, un certain nombre d’études ont montré une infection in vivo des cellules T CD Plusieurs mécanismes non mutuellement exclusifs ont été proposés pour expliquer la présence d’ADN proviral du VIH dans les cellules T CD : la molécule de CD agissant comme récepteur du VIH ; Transmission du VIH par contact de cellule à cellule entre des lymphocytes CD et CD infectés de manière persistante ; Infection par le VIH des lymphocytes T CD du sang périphérique à travers la molécule de CD, pour laquelle l’expression génique est induite après l’activation à travers le complexe du récepteur des lymphocytes T [,,]; et l’infection par le VIH des lymphocytes CD au stade précurseur lorsqu’ils coexpriment CD et CD dans le thymus. L’analyse par grappes dans notre étude a montré que les variants du VIH dans les cellules T CD périphériques étaient étroitement apparentés aux variants thymiques du VIH, ce qui favorise l’hypothèse Les lymphocytes T étaient probablement infectés dans le thymus pendant la lymphopoïèse des lymphocytes T. Cette hypothèse est cohérente avec les résultats obtenus dans des études antérieures avec la souris SCID-hu Des études moléculaires du virus du sous-ensemble CDT circulante pourraient potentiellement indiquer un VIH thymique. Nous avons déjà introduit le concept de «dysfonction thymique» pour identifier une population périnatale de nourrissons infectés par le VIH présentant un profil immunophénotypique du sang périphérique ressemblant à celui de patients présentant une anomalie thymique congénitale sévère de DiGeorge [, ] Presque tous les nourrissons infectés par le VIH ayant ce profil avaient une progression rapide vers la mort liée au SIDA / VIH Th Les résultats de notre étude actuelle ont démontré que toute infection thymique du VIH ne conduirait pas forcément à un dysfonctionnement thymique sévère, car le patient présentait une progression relativement lente de la maladie. La différence peut dépendre de la variante VIH impliquée. Un rapport précédent identifiait un syncytium lymphocytotropique. Par contre, les séquences virales que nous avons isolées à la fois des PBMC et du tissu thymique de cet enfant prédisent des caractéristiques monocytotropes et non syncytiales. Le nombre de lymphocytes T CD et CD relativement conservés était en effet compatible avec un virus qui n’induit pas de destruction thymique extensive. Il pourrait être intriguant de supposer que le faible taux de divergence du variant thymique pourrait être lié à la lente progression de la maladie chez cet enfant. bien que des facteurs techniques tels que le stockage à long terme des spécimens aient pu nuire à notre capacité hétérogénéité des clones, nos résultats suggèrent que, même pour un patient sans profil de dysfonction thymique, un réservoir viral thymique peut être établi tôt après l’infection, se répliquant localement sans entraîner une déplétion importante des thymocytes. , l’épithélium thymique, les macrophages et les cellules dendritiques dans le stroma thymique peuvent être un substrat de la réplication du VIH Nous avons précédemment démontré que le virus thymique isolé de ce patient était capable d’infecter les épithéliums thymiques en culture l’ensemencement du thymus du nourrisson peut donc dicter la pathologie du thymus, qui à son tour influe sur le taux de progression de la maladie

Remerciements

Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits