Amélioration de la détection de Mycobacterium tuberculosis chez les enfants péruviens par l’utilisation d’un test de réaction en chaîne de la polymérase IS héminesté

Une nouvelle PCR a été évaluée comme un outil de diagnostic de la tuberculose chez les enfants. Dans une analyse des prélèvements gastriques, des aspirations nasopharyngées et des expectorations, les résultats de la PCR ont été comparés à ceux des méthodes de culture, bacille acido-alcoolo-résistant. coloration, et évaluation clinique par le score de Stegen-Toledo La sensibilité de PCR% était comparable à celle de la méthode de culture% et significativement plus élevée que celle de Löwenstein-Jensen% ou AFB% pour les enfants avec une détection hautement probable de la tuberculose. La spécificité de la PCR était de% chez les enfants témoins Comparée à la culture, la PCR a montré une sensibilité de%, une valeur prédictive positive de%, une spécificité de %, et une valeur prédictive négative de% κ = Avec l’évaluation clinique comme standard, la PCR avait une sensibilité de%, une valeur prédictive positive de la valeur de%, et une valeur prédictive négative de% κ = PCR est une méthode rapide et sensible pour le diagnostic précoce de la tuberculose pédiatrique

La tuberculose est l’un des problèmes de santé publique les plus répandus dans les pays en développement, affectant environ un million d’enfants chaque année. La tuberculose infantile est importante en raison de la morbidité et de la mortalité qui y sont associées et de la transmission active de la tuberculose. Les tests de laboratoire constituent un obstacle majeur au diagnostic de la tuberculose chez l’enfant, car la charge de l’organisme est généralement beaucoup plus faible que chez l’adulte. Dans les meilleures conditions, Mycobacterium tuberculosis est isolé dans <% des cas pédiatriques cliniquement suspectés. Symptômes caractéristiques de nombreux enfants, comparés à ceux des adultes Les symptômes de l'infection à M tuberculose sont souvent non spécifiques ou absents chez les enfants affectés Les échantillons de diagnostic clinique adéquats sont souvent difficiles à obtenir chez les enfants. ans en raison du manque de production d'expectorations ; Par conséquent, la plupart des cas sont toujours diagnostiqués sur la base des données cliniques et radiographiques et des informations de contact. Pour ces raisons, un test rapide pour le diagnostic précis de la tuberculose chez les enfants est urgent. Des tests rapides basés sur des techniques d'amplification ont été développés. détection directe des mycobactéries dans les échantillons cliniques Il reste à prouver si elles peuvent également répondre aux exigences de haute sensibilité et spécificité, simplicité et coût raisonnable. Le test d'amplification des acides nucléiques le plus connu est le test de PCR qui a été utilisé pour la première fois. pour détecter M tuberculosis avec l'utilisation du gène -kDa comme cible Eisenach et al ont décrit IS comme une séquence d'ADN répétitive du génome du complexe M tuberculosis, et ils ont utilisé la PCR pour détecter M tuberculosis dans des échantillons cliniques depuis lors, de nombreux tests basés sur la PCR, sensibles et rapides, dont la plupart utilisent la SI comme cible pour l'amplification de l'ADN mycobactérien, ont été développés pour la détection directe. Plus récemment, un large éventail de tests d'amplification des acides nucléiques ont été développés, dont quelques-uns ont été évalués en laboratoire clinique et sont disponibles dans le commerce, y compris la PCR. à base d'Amplicor Roche, réaction en chaîne par ligase Lcx; Abbott Systems, amplification à médiation par transcription TMA; Gen-Probe, et amplification de déplacement de brin BDProbe; Tec-SDA Les faibles sensibilités et coûts élevés de ces tests ont jusqu'ici empêché leur utilisation dans la détection de la tuberculose pédiatrique. Ces dernières années, plusieurs études impliquant de petits groupes d'enfants ont examiné l'utilité de la PCR dans le diagnostic de la tuberculose pulmonaire pédiatrique. Les principaux inconvénients rapportés des tests de diagnostic PCR sont les limites de leur spécificité, la nécessité d'obtenir plusieurs échantillons pour optimiser le rendement, leur coût élevé et la faible sensibilité des kits PCR disponibles dans le commerce L'efficacité de la PCR les tests varient considérablement selon la méthode de PCR utilisée, la cible du gène, le traitement des échantillons pour l'extraction de l'ADN et surtout les compétences opérationnelles du personnel de laboratoire et la technologie moléculaire standardisée. D'autres considérations influent sur la sensibilité et la spécificité du test. les précautions nécessaires pour prévenir la contamination, l'utilisation de contrôles appropriés et le nouveau test d'échantillons cliniques avec des doutes Résultats complets Tous les facteurs liés au test lui-même peuvent être optimisés et des résultats reproductibles précis peuvent être obtenus dans des conditions contrôlées. De plus, l'utilité clinique des tests diagnostiques basés sur la PCR dépend des valeurs prédictives positives et négatives. tuberculose, il est essentiel de prendre en compte l'épidémiologie régionale pour déterminer l'utilité d'un test de diagnostic par PCR Nous avons déjà utilisé une analyse par IS PCR développée par SHM à la Ochsner Clinic de La Nouvelle-Orléans, LA. , et technique sensible pour la détection du complexe M tuberculosis dans des échantillons cliniques obtenus chez l'adulte Nous avons amélioré la méthode initiale en développant un test PCR héminesté, dans le but d'améliorer la sensibilité de détection du complexe M tuberculosis dans les frottis paucibacillaires. spécimens négatifs Le but de cette étude était de: évaluer la performance des héminestés Analyse par PCR des échantillons prélevés chez des enfants présentant des manifestations cliniques variées de tuberculose, comparaison des résultats de la PCR avec ceux des bacilles acido-alcoolo-résistants conventionnels, et comparaison de la valeur diagnostique de différents types d'échantillons prélevés chez des enfants suspects. tuberculose

Patients et méthodes

Population étudiée Cette étude, menée de novembre à mai, a porté sur des enfants référés à l’Instituto de Salud del Niño à Lima, au Pérou. Tous les participants ont été admis dans le service de pneumologie ou ont été vus dans la clinique externe de tuberculose avec un diagnostic présomptif de maladie pulmonaire. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de leurs parents ou tuteurs, et les enfants de ⩾ ans ont donné leur assentiment avec une déclaration écrite d’assentiment, selon les directives du conseil d’examen institutionnel. Lignes directrices d’expérimentation humaine du Département américain de la Santé et des Services sociaux Washington, DC et Asociación Benéfica PRISMA Lima, Pérou ont été suivis dans la conduite de cette recherche Le protocole d’étude et le consentement éclairé ont été approuvés par les conseils d’établissement de l’Institut de Salud del Niño et Johns Hopkins University Baltimore, MD. évalué clinique s ymptoms, antécédents de contact avec des tuberculeux, diagnostic antérieur de tuberculose et données démographiques Un total de% des enfants présentait des signes de vaccination bacille Calmette-Guérin ie présence de cicatrices. Un test PPD de dérivé protéique purifié a été appliqué, et la réponse a été mesurée quelques jours plus tard Tous les patients ont subi une radiographie thoracique, dont les résultats ont été évalués par un pneumologue aveugle au diagnostic clinique du patientCritères pour le diagnostic clinique de la tuberculose pédiatrique Pour évaluer le diagnostic de tuberculose pulmonaire, un ensemble de critères cliniques utilisés au Pérou, adapté Les critères de Stegen-Toledo sont basés sur les signes et les symptômes, tels que la toux persistante, les anomalies de la radiographie thoracique et le contact avec un patient atteint de tuberculose active, selon les critères de Stegen-Kaplan . Les patients ont été classés en catégories, selon le score clinique de Stegen-Toledo pour le diagnostic de table de tuberculose diatrique: pour une tuberculose improbable, le score était -; pour suspicion de tuberculose, -; pour une tuberculose probable, -; et pour la tuberculose hautement probable, ⩾ Un groupe d’enfants sans suspicion de tuberculose score de Stegen-Toledo, – a été inclus en tant que groupe de contrôle

Table View largeTélécharger slideStegen-Toledo ensemble de critères pour le diagnostic de tuberculose TB chez les enfants péruviensTable View largeTélécharger slideStegen-Toledo ensemble de critères pour le diagnostic de tuberculose TB chez les enfants péruviensChantillons cliniques Des échantillons cliniques, y compris des prélèvements gastriques, des prélèvements nasopharyngés et des expectorations ont été collectés le matin pendant des jours consécutifs Les aspirats nasopharyngiens ont été recueillis par insertion d’un tube nasopharyngien souple et flexible dans le nasopharynx et par aspiration des sécrétions respiratoires dans un récipient à l’aide d’un aspirateur Gomco ou d’un aspirateur portatif. par intubation nasogastrique Toutes les intubations ont été réalisées tôt le matin, et le volume des aspirations gastriques a été augmenté en injectant des mL d’eau stérile et en effectuant une réaspiration au besoin. Microscopie des frottis de l’AFB Tous les échantillons ont été digérés et décontaminés avec NaOH N-acétyl-L-cystéine méthode Ziehl-Nee La coloration de lsen ZN et d’auramine-O a été effectuée en utilisant des techniques standard Cultures forM tuberculosis Trois méthodes de culture ont été utilisées pour l’isolement maximal des tubes indicateurs de croissance des mycobactéries M Becton Dickinson Microbiology Systems [BDMS] contenant% OADC acide oléique, albumine, dextrose, et la catalase; BDMS et μL de PANTA polymyxine B, amphotéricine B, acide nalidixique, triméthoprime et azlocilline; Le supplément antimicrobien BDMS a été inoculé avec μL d’échantillon décontaminé, incubé à ° C selon les instructions du fabricant, et examiné pour la croissance mycobactérienne tous les deux jours pendant des semaines en utilisant un transilluminateur UV -nm, comme décrit par le fabricantBoth Löwenstein-Jensen LJ slants Difco Laboratories et Middlebrook -mm microagar H médium plaques BDMS ont été inoculés avec μL d’échantillon décontaminé, incubé à ° C avec ou sans% CO, et examiné avec un microscope à lumière inversée pour la croissance mycobactérienne au moins une fois par semaine pendant semaines – après Des échantillons décontaminés – μL ont été traités avec de l’éthanol absolu pour rendre les mycobactéries non viables Le matériel a été granulé par centrifugation, et l’ADN a été extrait comme indiqué ailleurs , avec la variation que% Laboratoires Chelex-Bio-Rad a été ajoutée à les Lysats de tampon de lyse ont été centrifugés pour éliminer les débris cellulaires, et μL du surnageant a été directement ajouté au mélange PCR. La PCR N-PCR HEMinested IS implique des amplifications séquentielles qui utilisent les Pt / Pt externes et les amorces internes TB / Pt qui amplifient Le mélange réactionnel PCR et le thermocycleur ont été modifiés comme suit: μM d’amorces externes utilisées pour les cycles et μM d’amorces internes utilisées pour les cycles ont été utilisés dans un mélange réactionnel de -μL contenant mM de MgCl, mM de SO, U de Taq polymérase Promega, et ng de TaqStart Clontech dans un tampon PCR × PromegaAnalyse statistique Les tests exacts de χ, McNemar et Fisher ont été utilisés pour mesurer les forces de l’association entre les variables catégoriques. utilisé pour comparer les variables continues La fiabilité du test de diagnostic a été évaluée en calculant les valeurs de κ, avec κ & gt; indiquant une très bonne fiabilité, κ = – indiquant une fiabilité passable à bonne, et κ & lt; indiquant une mauvaise fiabilité

Résultats

Un total d’enfants ont été inclus dans l’étude, et les spécimens cliniques qui ont été obtenus de ces enfants ont été examinés nombre moyen de spécimens obtenus, spécimens par enfant; gamme, – spécimens par enfant La population étudiée comprenait les garçons et les filles; Répartition moyenne de la population étudiée selon les critères cliniques de Stegen-Toledo La tuberculose catégorisée est hautement probable chez les enfants, probable chez les enfants, suspectée chez les enfants et peu probable chez les enfants. examinés comprenaient des aspirats gastriques, des aspirations nasopharyngées, des échantillons d’expectorations et d’autres

Tableau View largeDownload slideDistribution de la population étudiée, selon la définition de cas clinique de Stegen-Toledo pour la tuberculose pédiatrique TB au PérouTable View largeTélécharger la diapositiveDistribution de la population étudiée, selon la définition de cas clinique de Stegen-Toledo pour tuberculose tuberculeuse au PérouTable montre la sensibilité et spécificité de la N-PCR, avec culture utilisée comme étalon de référence pour les enfants tuberculeux classés selon les critères cliniques de Stegen-Toledo La sensibilité de la N-PCR augmente avec la charge bacillaire: les taux de détection globaux sont de% dans les frottis AFB échantillons et% dans les échantillons à frottis négatif La spécificité de la N-PCR était de% pour les enfants avec des résultats cliniques négatifs Score de Stegen-Toledo, – et% pour les enfants avec divers degrés de suspicion de tuberculose

Tableau View largeTélécharger la lameSensibilité et spécificité de la PCR IS héminestée par rapport à la culture pour le diagnostic de divers degrés de tuberculose pédiatrique cliniquement suspectée TBTable View largeTélécharger diapositiveSensibilité et spécificité de la PCR IS héminestée par rapport à la culture pour le diagnostic de tuberculose pédiatrique cliniquement suspectée TBFigure montre les résultats de PCR, culture LJ, et AFB analyse de frottis avec utilisation de la coloration ZN seule ou ZN tache plus auramine chez les enfants avec un score de tuberculose fortement probable Stegen-Toledo, qui ont été regroupés selon les résultats de la culture et frottis AFB PCR détectée M tuberculose en% des enfants de; ce taux de détection était comparable au taux de détection de% d’enfants obtenus avec l’utilisation de milieux de culture et était significativement plus élevé que le pourcentage de% obtenu avec la coloration LBA couramment utilisée pour la coloration LJ détecté% des cas où la coloration ZN et la coloration auramine étaient utilisé, et il a détecté% des cas où la coloration ZN a été utilisée seule

Vue de la figure largeDownload slideRésultats de l’utilisation de la N-PCR PCR héminestée, de la culture LJ de Löwenstein-Jensen et de la coloration ZN du bacille acido-résistant, coloration de Ziehl-Neelsen uniquement; NZA, coloration de Ziehl-Neelsen et coloration à l’auramine pour diagnostiquer la tuberculose tuberculeuse chez les enfants atteints de tuberculose hautement probable selon les critères de Stegen-Toledo Le premier ensemble de barres montre les résultats pour tous les enfants de ce groupe clinique n = deuxième, troisième et quatrième les barres montrent les résultats pour les enfants de tous les sous-groupes, sur la base des résultats de culture et de frottis. Les résultats de culture indiquent les méthodes combinées * Significativement différent de la N-PCR P & lt ;; † Différemment significativement différent de la N-PCR P & lt; par le test exact de McNemarFigure View largeDownload slideRésultats de l’utilisation de la N-PCR PCR héminestée, de la culture LJ de Löwenstein-Jensen et de la coloration ZN de Ziehl-Neelsen; NZA, coloration de Ziehl-Neelsen et coloration à l’auramine pour diagnostiquer la tuberculose tuberculeuse chez les enfants atteints de tuberculose hautement probable selon les critères de Stegen-Toledo Le premier ensemble de barres montre les résultats pour tous les enfants de ce groupe clinique n = deuxième, troisième et quatrième les barres montrent les résultats pour les enfants de tous les sous-groupes, sur la base des résultats de culture et de frottis. Les résultats de culture indiquent les méthodes combinées * Significativement différent de la N-PCR P & lt ;; † Significativement différent de la N-PCR P & lt; par le test exact de McNemarTable analyse les caractéristiques cliniques des enfants présentant divers degrés de tuberculose cliniquement soupçonnés ayant des résultats de PCR positifs mais des résultats négatifs de culture et de coloration des BAAR Sept% de ces enfants présentaient une toux persistante ou induration PPD de ⩾ mm, et% avait été en contact avec un patient atteint de tuberculose active

Tableau View largeTélécharger les caractéristiques démographiques et cliniques des enfants avec des résultats positifs de PCR IS héminesté et des résultats négatifs de la culture et coloration bacillaire acido-résistante pour la détection de la tuberculose TBTable View largeTélécharger les caractéristiques démographiques et cliniques des enfants avec des résultats positifs de PCR IS héminesté et négatif résultats de culture et coloration bacillaire acido-résistante pour la détection de la tuberculose La culture positive de M tuberculosis a été démontrée pour chaque échantillon prélevé sur chacun des enfants. Cent vingt et un échantillons prélevés chez ce groupe d’enfants ont été examinés. Le taux de détection de M tuberculosis par PCR a augmenté avec une augmentation du nombre de spécimens examinés pour les échantillons à frottis négatif. Dans notre échantillon, la récupération de M tuberculosis à partir de spécimens ayant un frottis négatif et culture positive a augmenté de% un seul échantillon a été testé pour % lorsque les spécimens ont été testés

Figure Vue largeTéléchargement Comparaison de l’utilisation de spécimens simples versus multiples pour le diagnostic de tuberculose par PCR héminestinée chez des enfants pour lesquels la culture de la tuberculose était positive Les données en haut de chaque barre indiquent le non des enfants avec un résultat positif / total non. Enfants évaluésFigure View largeTélécharger slideComparaison de l’utilisation de spécimens simples versus multiples pour le diagnostic de tuberculose par PCR héminestinisée chez des enfants pour lesquels la culture de la tuberculose était positive Les données en haut de chaque barre sont le non des enfants avec un résultat positif / total non La comparaison de N-PCR avec la culture pour la détection de M tuberculosis chez les enfants, selon le type de spécimen analysé individuellement, est montrée dans le tableau Les résultats de sensibilité étaient% pour les échantillons d’expectoration,% pour les aspirations gastriques et nasopharyngées les valeurs étaient% pour les échantillons d’expectorations,% pour les aspirations gastriques, et% pour les aspirations nasopharyngiennes Avec tous les spécimens ens, valeur prédictive négative Les paramètres NPV étaient ⩾% Valeurs prédictives positives Les VPP étaient respectivement de%,% et% pour les échantillons d’expectorations, les aspirations gastriques et les aspirations naso-pharyngiennes.

Tableau View largeTélécharger la lameComparaison de la PCR N-PCR héminestée avec culture pour la détection de Mycobacterium tuberculosis chez les enfants péruviens, selon le type d’échantillon testéTable Voir grandDownload slideComparaison de la N-PCR PCR héminestée avec culture pour la détection de Mycobacterium tuberculosis en péruvien enfants, selon le type de spécimen testé performance de test N-PCR, avec l’utilisation de critères cliniques ou la culture comme la norme pour le diagnostic de la tuberculose, est présenté dans le tableau Lorsque la culture a été utilisée comme standard, N-PCR a une forte score de fiabilité du test κ =; ses paramètres de test étaient une sensibilité de%, une spécificité de%, une VPP de% et une VAN de% Avec l’évaluation clinique comme standard pour le groupe avec tuberculose hautement probable, les paramètres de test N-PCR étaient une sensibilité de%, une spécificité de%, une VPP de%, une VAN de%, et un bon score de fiabilité de test κ = Corrélations des résultats de culture LJ seule versus évaluation clinique comme étalon de référence étaient une sensibilité de%, une spécificité de%, une VPP de %, et une VAN de% κ = Lorsque les cultures étaient utilisées, les corrélations par rapport à l’étalon clinique de référence étaient une sensibilité de%, une spécificité de%, une VPP de%, une VAN de% et un bon score de fiabilité de test

Tableau View largeTélécharger slideRésultats de la N-PCR de l’IS PCRHeminested, avec culture et évaluation clinique comme standards de référence, pour le diagnostic de la tuberculose chez les enfants péruviensTable View largeTélécharger la lameRésultats de la N-PCR PCR incubée, avec culture et évaluation clinique comme standards de référence, pour le diagnostic de la tuberculose chez les enfants péruviens

Discussion

En revanche, la charge en bacilles semble être un facteur, car les résultats faussement négatifs étaient presque exclusivement limités aux échantillons à frottis négatif. cette étude, le test N-PCR a été plus affecté par les paramètres qui limitent la récupération de M tuberculosis en culture, tels que l’inoculum d’échantillon et le nombre de spécimens. Il est à noter que chez les enfants qui ont une tuberculose hautement probable sur la base de la Le score clinique de Stegen-Toledo a également eu des résultats négatifs sur la culture et, chez ces enfants, un résultat PCR positif Globalement, lorsque la culture était utilisée comme standard, la PCR avait une spécificité de% table Ces données suggèrent un bon accord entre culture et PCR dans ces cas, les enfants avec des résultats de PCR positifs et des résultats de culture négatifs peuvent être des patients avec de vrais cas de tuberculose, de sorte que le% de spécificité Le score de Stegen-Toledo peut manquer de spécificité, car les patients qui ont atteint le seuil du score clinique ont des résultats négatifs à la fois en culture et en PCR. Cela devrait refléter davantage les insuffisances du système de notation de Stegen-Toledo, bien que Pour ces enfants, les cas de tuberculose pourraient ne pas avoir été détectés par l’une ou l’autre méthode, car les cas de tuberculose primaire qui n’ont pas encore pénétré dans les bronches seraient difficilement détectés par les dosages des sécrétions respiratoires. pour des techniques améliorées et spécifiques de concentration d’ADN de tuberculose M, l’utilisation d’ADN cible plus petit pour une PCR plus robuste et / ou l’utilisation de sondes moléculaires vertes SYBR pour une détection plus sensible des produits PCR peut réduire le nombre de ces résultats de PCR faussement négatifsSpécificité et VPP peut être difficile à évaluer dans une zone d’hyperendémicité; La confirmation des résultats faussement positifs est extrêmement difficile car le test de référence-culture-manque de sensibilité N-PCR a une spécificité acceptable et des valeurs NPV de% et de%, respectivement caustique. De plus, la spécificité du test chez les enfants sans facteur de risque pulmonaire score de Stegen-Toledo tuberculosis, – was% Par conséquent, trouver des patients positifs pour la culture PCR-négative dans une population à haut risque, comme au Pérou ~% de cas négatifs pour la culture dans toutes les catégories cliniques de Stegen-Toledo peut indiquer la présence de tuberculose précoce ou subclinique Dans les études futures, un suivi longitudinal des enfants ayant des résultats positifs à la N-PCR et des résultats de culture négatifs sera effectué pour vérifier cette hypothèse. Entre-temps, les cliniciens pourraient envisager de Les résultats de la PCR et la maladie compatible ont des preuves de la tuberculose, même dans les cas où les résultats de la culture de la tuberculose sont finalement négatifs. Les données présentées dans le tableau, qui montrent une récupération différentielle entre la culture LJ seule et une approche de culture de méthode, illustrent les insuffisances des techniques conventionnelles de culture de la tuberculose. L’exclusion de la tuberculose chez les enfants avec des présentations cliniques hautement suspectes est difficile. pas un étalon de référence fiable Dans cette étude, parmi les enfants ayant des résultats négatifs au frottis et à la culture mais présentant également une tuberculose hautement probable, le score de Stegen-Toledo, -,% présentaient des résultats positifs au PPD, avec une induration moyenne en mm, – mm ; % avaient des antécédents de contact avec un patient atteint de tuberculose; Neuf enfants qui avaient un score clinique indiquant une tuberculose suspectée à hautement probable mais dont les résultats de culture négatifs avaient un résultat positif à la PCR, et un de ces patients, qui présentait un mm d’induration au test PPD et une radiographie pulmonaire miliaire On a trouvé que le résultat de la PCR était vrai-positif sur la seule base des résultats cliniques. Trois autres avaient des réactions PPD de ⩾ mm d’induration et avaient toutes des réactions PPD de ⩾ mm d’induration. La plupart de ces patients présentaient une toux chronique et un contact avec Des études ultérieures sur des enfants avec des échantillons positifs à la PCR et négatifs pour la culture seront nécessaires pour établir la vraie sensibilité et la VPP du test PCR dans ces cas. En fin de compte, la tuberculose pédiatrique est encore difficile et difficile diagnostiquer sans équivoque le diagnostic moléculaire de la tuberculose par N-PCR a un grand potentiel pour améliorer la capacité du clinicien à diagnostiquer p pediatric tuberculose ulcéreuse, et d’autres études sont nécessaires pour vérifier cliniquement ses performances et la reproductibilité de ses résultats. Avec le temps et l’expérience, la N-PCR peut jouer un rôle important dans l’approche diagnostique de la tuberculose pédiatrique. reconnaissant sa valeur potentielle dans les pays en développement où la maladie est hyperendémique